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    農業論文

    靶向蛋白質組學技術在多物種奶及其奶制品鑒別中的應用研究

    時間:2021年09月09日 所屬分類:農業論文 點擊次數:

    摘要基于靶向蛋白質組學技術,采用超高效液相色譜-串聯高分辨質譜/串聯三重四極桿質譜,建立了一種鑒別奶牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、驢和駱駝共8個物種奶的分析方法。針對8個物種奶中6種乳蛋白酶解產生的特征多肽進行分析,利用同位素內標法實現多條多

      摘要基于靶向蛋白質組學技術,采用超高效液相色譜-串聯高分辨質譜/串聯三重四極桿質譜,建立了一種鑒別奶牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、驢和駱駝共8個物種奶的分析方法。針對8個物種奶中6種乳蛋白酶解產生的特征多肽進行分析,利用同位素內標法實現多條多肽的同時檢測及比較,通過理論多肽分析、實際多肽檢測、干擾考察、線性與最大酶解時間比較,最終篩選出13條特征多肽。依據13條特征多肽對模擬混合奶樣品中的不同物種奶進行分析,對市售16個奶制品中的奶源物種進行鑒別。結果表明,特征多肽在奶源物種鑒別中具有良好的穩定性與特異性,本方法對多物種奶制品行業的質量控制與監管具有參考價值。

      關鍵詞靶向蛋白質組學;液相色譜-質譜聯用技術;物種鑒別;乳蛋白

    蛋白質論文

      奶制品是日常膳食體系中常見的飲品和營養攝入源之一。常見的奶制品除奶牛奶外,還有山羊奶、綿羊奶、水牛奶、牦牛奶、馬奶、驢奶和駱駝奶等產量較少的奶源,這些奶各具獨特營養價值[1-4]。例如,山羊奶致敏性低[5],含有大量的脂肪和蛋白微粒,容易水解吸收[6-7];驢奶富含乳清蛋白,其乳清蛋白與酪蛋白的比例與人乳接近,更易于吸收[7];駱駝奶含有比奶牛奶高30倍的維生素C[8],并且富含內胰島素,可作為治療糖尿病的輔助食品[9-10]。

      蛋白質論文范例: 蛋白質-蛋白質相互作用的實驗檢測方法

      由于產量少且營養價值高,這些奶在市場上的價格高于奶牛奶。在利益的驅使下,這些奶及其奶制品在加工過程中存在摻入奶牛奶或直接以奶牛奶冒充等問題。因此,建立奶制品物種成分的鑒別方法以識別不同物種奶,對于奶制品行業的品質監管具有重要意義。目前,有關不同物種來源奶(簡稱多物種奶)的鑒別研究已有許多報道,例如,聚合酶鏈式反應法(PCR)[11]、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)[12]、凝膠電泳法[13]、高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)[14-15]和基質輔助激光解吸-飛行時間質譜法(MALDI-TOF)[16]等。PCR和ELISA法通過基因或抗原抗體免疫結合實現對多物種奶中標志物的識別,具有較高的靈敏度。

      但是,該類檢測方法通常僅適用于定性或半定量分析,并且易出現假陽性結果。HPLC-MS和MALDI-TOF法通過分子質荷比的分析實現對目標蛋白質的特異性識別。但是,由于蛋白質分子量大、修飾多,在諸如高溫滅菌奶、乳粉等奶制品加工過程中,其結構組成容易因溫度、壓力等因素的影響而發生變異,使檢測方法容易受到干擾。靶向蛋白質組學技術[17-18]是一種基于已知蛋白質氨基酸序列信息,利用蛋白酶水解結合HPLC-MS技術,篩選出待測目標蛋白質的特征多肽,并通過對特征多肽的檢測實現目標蛋白質定性和定量分析的方法。

      由于特征多肽序列短、質量數小、檢測的靈敏度和穩定性高,并且其結構組成在加工過程中受溫度和壓力等因素的影響較小[19],因此在全脂粉和嬰兒配方奶粉[20]等檢測中具很強的抗干擾能力。目前,靶向蛋白質組學技術已在水牛與奶牛乳清蛋白特征多肽鑒別[21-22]、山羊與奶牛的乳清蛋白差異分析[23]等方面得到應用。Camerini等[21]利用靶向蛋白質組學技術分析了水牛奶酪中殘留的乳清成分,并建立了鑒別水牛與奶牛β乳球蛋白的分析方法。

      Ke等[24]利用靶向蛋白質組學技術對山羊奶與奶牛奶中6種乳蛋白的特征多肽進行了對比與篩選,利用特征多肽實現了山羊奶制品中奶牛奶成分摻假的檢測。但是,目前的研究通常僅針對少數物種奶與奶牛奶的鑒別分析,由于奶制品行業中奶源物種繁多,建立一種針對多物種來源乳制品的同時檢測方法,有利于更全面地分析奶制品的物種來源,實現大批量奶制品的快速鑒別。本研究基于靶向蛋白質組學和液相色譜-質譜法相結合的鑒別方法,建立了奶牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、驢和駱駝8個物種奶的物種鑒別方法。本方法利用胰蛋白酶酶解技術和同位素二甲基衍生化技術作為輔助,實現了對物種的特征多肽的檢測,并鑒別了模擬樣品與實際奶制品中乳蛋白的物種來源。

      1實驗部分

      1.1儀器與試劑

      Q-Exactive超高效液相色譜組合型四極桿Orbitrap質譜儀(UHPLC-OrbitrapMS,美國ThermoFisher公司);TQ-XS超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀(UHPLC-TQMS,美國Waters公司);CascadaⅠ型超純水儀(美國Pall公司)二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、氰基硼氫化鈉(HPLC級,美國Sigma-Aldrich公司);甲醛、同位素甲醛(13CD2O)(HPLC級,美國Sigma-Aldrich公司);NaHCO3、氨水(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司);乙腈(ACN)、甲酸(FA)(HPLC級,德國Merck公司);測序級重組胰蛋白酶(Trypsin,上海雅心生物科技有限公司)31個純鮮奶樣(奶牛奶5個、水牛奶3個、牦牛奶5個、山羊奶5個、綿羊奶2個、驢奶和馬奶各3個、駱駝奶5個)均來自當地乳品企業。采樣后,立即在-20℃冷凍儲存。16個市售奶制品樣品(水牛鮮奶2個、牦牛鮮奶1個、牦牛高溫滅菌奶2個、牦牛乳粉1個、山羊鮮奶2個、山羊乳粉2個、綿羊乳粉2個、驢鮮奶1個、驢乳粉1個和駱駝鮮奶2個)通過網購或當地采購獲得。

      1.2標準曲線與模擬混合樣品的配制

      8個物種奶的標準樣品由各物種鮮奶與超純水混合配制,其混合比例(V/V)依次為0∶100、5∶95、10∶90、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20和100∶0。模擬混合樣品由奶牛奶與其它7個物種奶分別混合獲得,其混合比例(V/V)為0∶100,5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、100∶0。屬內物種間混合樣品,由牦牛奶與水牛奶,山羊奶與綿羊奶及驢奶與馬奶兩兩混合獲得,其混合比例(V/V)為0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100∶0。

      1.3樣品前處理

      1.3.1酶解準確稱取樣品(乳粉樣品0.05g,奶樣0.5mL),加入超純水充分溶解,定容至10mL。移取稀釋后的樣品溶液100μL于2mL離心管中,加入100μL超純水、500μL100mmol/LNaHCO3溶液、100μL100mmol/LDTT溶液,混勻,于70℃恒溫反應30min;冷卻至室溫,加入100μL300mmol/LIAA溶液,避光靜置30min;加入100μL100μg/mLTrypsin,混勻,于37℃恒溫酶解4h,冷卻至室溫,15000r/min離心5min,待二甲基化。

      1.3.2二甲基化反應從離心后樣品溶液中吸取100μL上清液,加入4μL1%(V/V)甲醛溶液(同位素內標樣品中加入等量同位素甲醛溶液)和4μL0.6mol/L氰基硼氫化鈉溶液,在室溫下反應1h。加入16μL1%(V/V)氨水,中止二甲基化反應,并加入10μL甲酸中和過量的氨水,于室溫下靜置至樣品溶液不再產生氣泡。取50μL二甲基化后的樣品溶液與50μL同位素二甲基化的內標溶液混合,待測。

      1.4液相色譜條件色譜柱:ACQUITYUPLCBEH300C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm,30nm);柱溫35℃;進樣量:10μL;自動進樣器溫度:15℃;色譜流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液,流速:0.3mL/min。梯度洗脫:0~1min,2%B;1~4.5min,2%~80%B;4.5~5.5min,80%~100%B;5.5~6.5min,100%B;6.5~7min,100%~2%B;7~9min,2%B。

      1.5Orbitrap質譜條件鞘氣流量:40L/min;輔助氣流量:10L/min;離子源電壓:3.5kV;毛細管溫度:320℃;輔助氣溫度:350℃。質譜檢測掃描范圍:m/z200~3000;分辨率:70000;AGCtarget3e6;最大進樣時間:100ms。dd-MS2參數為分辨率17500,AGCtarget1e5,最大進樣時間為50ms,循環計數為10,質量間隔窗口為m/z4.0。蛋白質分析軟件Proteomediscoverer2.1(美國Thermo-Fisher公司)參數為酶切模式Trypsin;漏切位點0~2;質量偏移為10ppm(10-6);氨基酸固定修飾:半胱氨酸的甲;,多肽N端以及賴氨酸的二甲基化;氨基酸的動態修飾:磷酸化和氧化。

      1.6三重四極桿質譜條件毛細管電壓:3.0kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑溫度:350℃;脫溶劑氣流量:800L/min;錐孔反吹氣流量:150L/h;質譜碰撞氣流量0.12mL/min。所得數據由Masslynx軟件采集(美國Waters公司)。

      2結果與討論

      2.1理論特征多肽的序列分析

      常見的乳蛋白主要分為乳清蛋白和酪蛋白兩大類,在乳清蛋白中,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是主要的組成部分;在酪蛋白中,αs1酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白是主要的組成部分。這6種蛋白的含量常占乳蛋白組成的90%以上,是各物種最具代表性的乳蛋白。故本研究主要針對8個物種奶中的上述6個乳蛋白進行分析,其中,僅駱駝奶不含有β-乳球蛋白。

      為了確定各乳蛋白中具有物種代表性的多肽,首先對乳蛋白的氨基酸序列進行了理論分析。通過Uniprot數據庫查詢,獲得共計47種乳蛋白的氨基酸序列信息。通過模擬Trypsin酶切,對相應多肽進行特異性篩選[21,24]。以奶牛奶為例,對奶牛與其它7個物種乳蛋白的氨基酸序列進行了比較,在奶牛奶的6種乳蛋白中,篩選出6條在其它物種乳蛋白中無重復氨基酸序列的理論特征多肽。

      通過美國國家生物信息中心(NCBI)網站提供的蛋白質數據庫中的局部序列比對工具(BLAST)對這6條多肽在已知的8個物種蛋白質數據庫中的信息進行比對分析,結果表明,在數據庫中沒有其它蛋白質包含與這6條多肽一致的氨基酸序列,證明這些多肽具有物種特異性。通過相同方式,在其余7個物種乳蛋白中篩選出總計110條理論特征多肽,詳見電子版文后支持信息表S1~S7。

      2.2理論特征多肽的靜電場軌道阱質譜檢測

      為確認理論特征多肽是否存在于實際奶制品中,使用UHPLC-OrbitrapMS對按照1.3節所述步驟處理后的8個物種奶樣中的多肽進行分析,并使用數據關聯監測模式(ddms2)對多肽的二級質譜信息進行采集。采集到的數據通過軟件Proteomediscoverer2.1進行處理,以Uniprot數據庫信息作為參考,對8個物種奶樣品的質譜數據進行篩選匹配。

      2.3特征多肽的篩選

      2.3.1特征多肽的二甲基衍生化

      依據各候選特征多肽的OrbitrapMS數據,利用UHPLC-TQMS建立相應的多反應監測(MRM)檢測方法。奶牛奶、水牛奶和牦牛奶候選特征多肽的MRM參數,其余物種的特征多肽MRM參數見電子版文后支持信息表S8~S10。為了克服質譜離子化效率及穩定性對候選多肽的影響,采用同位素標記法對候選特征多肽進行校正。

      考慮到本研究包含的目標候選多肽數量較多,常見的合成同位素多肽法所需的時間與經濟成本過高,本研究采用同位素二甲基衍生化法[26]對所研究的目標多肽進行同位素標記。針對同一種多肽,以其二甲基衍生化產物與同位素二甲基衍生化產物峰面積比值作為其相對峰面積,實現內標法檢測。為確保所有候選多肽都能被完全衍生化,首先考察了各候選多肽的二甲基衍生化效率。在二甲基衍生化與同位素二甲基衍生化處理的樣品中,均未發現未被衍生化的多肽,表明其衍生化效率高。同時,二甲基衍生化的多肽與同位素二甲基衍生化的多肽之間不存在干擾。

      2.3.2特征多肽酶解水平與線性考察

      在確定MRM參數以及二甲基衍生化效率之后,本研究考察了候選特征多肽在0~6h(0、0.5、1、2、3、4和6h)內的酶解水平,平行實驗3次,比較了各多肽達到最大酶解程度所需的時間。如表2所示,奶牛奶、水牛奶、牦牛奶的10條候選多肽酶解程度均可在3h內達到最大,表明多肽酶解效率較高;但水牛奶多肽YNVPQLEIVPNLAEEQLHSMK等4條多肽(表2中標記*)在達到最大酶解水平后的幾個小時內含量明顯下降,表明其穩定性或抗基質干擾能力較弱。

      奶牛、水牛和牦牛3個物種奶的候選多肽的線性結果。奶牛與牦牛奶的候選特征多肽均表現出良好的線性關系,其線性相關系數r2均大于0.994。在水牛奶的候選多肽中,多肽FQSEEQQQMEDELQDK與多肽FFNDK線性相關系數均低于0.95,多肽LSFNPTQLEEQCHV與SCQAQPTTMTR線性相關系數大于0.99,具有較好的線性關系。

      依據實驗結果,奶牛奶與牦牛奶中候選多肽符合酶解水平與線性考察的要求,因此確定候選多肽LSFNPTQLEEQCHI(奶牛)與LSFNPTQLEGQCHI(牦牛)即為其對應物種的特征多肽;而在水牛奶中,選擇來自乳清蛋白的候選多肽LSFNPTQLEEQCHV(水牛)與來自酪蛋白的特征多肽SCQAQPTTMTRK(水牛)共同作為水牛奶特征多肽。此外,同時采用兩條多肽可識別目標蛋白,以確定其來源于水牛酪蛋白,還是來源于水牛乳清蛋白,在嬰兒配方粉等強化奶制品中可以實現乳清蛋白與酪蛋白的分別鑒定。同理,在其余5個物種奶中,共有9條多肽(除驢奶1條以外,其余物種奶均選擇乳清蛋白與酪蛋白中特征多肽各1條)被最終選作對應的特征多肽。

      2.4模擬混合樣品的檢測

      為考察所篩選的13條特征多肽對各物種奶的分辨能力,采用上述方法對奶牛奶與其它7個物種奶的模擬混合樣品進行了MRM檢測,以奶牛奶標準曲線樣品作為參考,分析各混合樣品中奶牛奶特征多肽的含量,并計算出奶牛奶的混合比例。同理,以各物種奶標準曲線樣品作為參考,獲得對應混合樣品中各物種奶的混合比例,并與理論值進行比較,結果見電子版文后支持信息表S11。通過各物種奶特征多肽計算的樣品混合比例與理論混合比例基本一致,并且依據多肽計算的比例所繪制的濃度曲線線性相關系數均大于0.99,表明各物種奶特征多肽在與奶牛奶混合樣品的鑒別過程中可保持良好的特異性。

      3結論

      本研究基于靶向蛋白質組學的分析原理,采用UHPLC-OrbitrapMS與UHPLC-TQMS,建立了奶牛、水牛、牦牛,山羊、綿羊,驢、馬和駱駝8個不同物種奶的鑒別方法。利用二甲基衍生化實現對不同物種來源的多條多肽的分析比較,最終篩選出13條具有物種特異性的特征多肽,實現了對混合樣品及實際奶制品中乳蛋白物種來源的鑒別。研究結果表明,特征多肽分析在多物種乳蛋白鑒別過程中不僅表現出良好的穩定性、特異性,同時還可滿足高溫滅菌乳或乳粉等加工奶制品的檢測需求。本研究有望在奶制品行業的品質監管中發揮積極作用。

      References

      [1]BARLOWSKAJ,SZWAJKOWSKAM,LITWICZUKZ,KRLJ.Compr.Rev.Food.Sci.FoodSaf.,2011,10(6):291-302.

      [2]SHENGQH,LIJC,ALAMMS,FANGXP,GUOMR.Int.J.FoodSci.Tech.,2008,43(3):568-572.

      [3]WANGJG,SUNYJ,MANGL.FoodRes.Dev.,2006,22:261-367.

      [4]VINCENZETTIS,POLIDORIP,MARIANIP,CAMMERTONIN,FANTUZF,VITAA.FoodChem.,2007,106(2):640-649.

      [5]HAENLEING.SmallRuminantRes.,2004,51(2):155-163.

      [6]BARRIONUEVOM,ALFEREZMJM,ALIAGAIL,SAMPELAYOMRS,CAMPOSMS.J.DairySci.,2002,85(3):657-664.

      作者:陳雨湉1任一平2王麗麗*1黃忠平*1

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