<noframes id="ll9r9"><address id="ll9r9"><nobr id="ll9r9"></nobr></address>
<noframes id="ll9r9">
<noframes id="ll9r9"><form id="ll9r9"></form>
    <em id="ll9r9"><form id="ll9r9"><th id="ll9r9"></th></form></em>
    容易發表/成功率高的期刊
    在線客服

    咨詢客服 咨詢客服

    咨詢郵箱:hz2326495849@163.com

    醫學論文

    分離技術在新型冠狀病毒研究和防疫檢測中的應用

    時間:2021年06月07日 所屬分類:醫學論文 點擊次數:

    摘要:新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情的爆發給世界公共衛生安全帶來前所未有的挑戰。隨著新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)相關研究的不斷深入,眾多分析檢測技術相繼被應用,推動了病毒檢測、疫苗和創新療法的研發,從而使疫情早日得到控制。分離技術作為生命科學

      摘要:新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情的爆發給世界公共衛生安全帶來前所未有的挑戰。隨著新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)相關研究的不斷深入,眾多分析檢測技術相繼被應用,推動了病毒檢測、疫苗和創新療法的研發,從而使疫情早日得到控制。分離技術作為生命科學、醫學、藥學領域的關鍵技術,操作簡單,分離效率高,選擇性強,在新型冠狀病毒的分離、檢測、診療及防疫中起到不可替代的作用。該文以SARS-CoV-2或COVID-19為關鍵詞在ISIWebofScience中進行主題檢索,歸納了2020年度新型冠狀病毒相關的研究論文,簡要介紹主要的研究方向,并對國際頂級學術期刊Nature,Science,Cell的論文發表情況進行了統計。通過檢索影響因子較高的期刊,綜述了新型冠狀病毒研究中主要應用的分離技術,并從親和色譜和尺寸排阻色譜、液相色譜、磁珠分離、離心、微納分離以及電泳6個方面進行說明。綜述統計了親和色譜和尺寸排阻色譜純化的病毒相關蛋白,并介紹了其在新型冠狀病毒傳播、感染機制以及藥物篩選中的應用;介紹了液相色譜對病毒候選藥物評估以及復雜基質中單一成分的鑒定;介紹了磁珠分離在細胞分離、核酸提取和免疫學檢測中的應用;介紹了離心對病毒顆粒、細胞以及血清的分離;介紹了微納分離結合其他技術以實現病毒蛋白的高靈敏檢測;簡要介紹了電泳在聚合酶鏈式反應(PCR)產物分析中的應用。該文綜述了2020年度新型冠狀病毒研究和防疫檢測中分離技術的應用情況,分析了分離技術在新型冠狀病毒檢測中發揮的作用,旨在為從事分離研究的科研工作者提供一些參考。

      關鍵詞:分離技術;親和色譜;尺寸排阻色譜;液相色譜;磁珠分離;離心;微納分離;電泳;新型冠狀病毒

    防疫檢測

      2020年1月爆發的新型冠狀病毒肺炎(COV-ID-19)在短時間內迅速蔓延全球,給世界公共衛生體系帶來了前所未有的挑戰[1]。國際病毒分類委員會將引發新冠肺炎的病毒命名為嚴重性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2),它是一種單股正鏈RNA病毒(β-冠狀病毒屬),早期通過表面凸起的刺突糖蛋白(S蛋白)結合受體細胞的血管緊張素轉換酶2(ACE2),后經細胞內2型跨膜絲氨酸蛋白酶裂解ACE2并激活S蛋白來促進病毒吸收,進而引起病變[2]。

      目前,疫情已持續1年多,全球累計確診病例超1.18億例,且仍呈增加趨勢。為了盡快控制疫情,全球科研和臨床醫護人員聯手攻關,從病毒的傳播途徑、感染致病機制、快速檢測診斷、疫苗開發等多方面開展研究,在短時間內取得了一系列突破進展。分離技術作為生命科學、醫學、藥學等領域的關鍵技術,在新型冠狀病毒研究中發揮了不可替代的作用。其中,以色譜為代表的現代分離技術,在實現病毒微量蛋白質純化的同時能保持蛋白質活性和分子結構完整,適用于發病機制、疫苗研發、臨床治療等研究。而以離心為代表的傳統分離技術,是新型冠狀病毒研究的基礎技術手段,方法簡單快捷,可初步分離病毒、細菌等大顆粒物質。

      2020年新型冠狀病毒研究文獻數量分布Fig.1NumberdistributionofresearchpapersonSARA-CoV-2in2020SARS-CoV-2:severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2.本文以“COVID-19”或“SARA-CoV-2”為關鍵詞,在ISIWebofScience數據庫中進行主題檢索, 截至2020年12月31日為止,相關期刊論文已達26160篇,研究方向包括普通內科學、公共環境衛生、傳染病學、藥理學、分子生物學、化學等。

      其中,國際頂級學術期刊Nature,Science和Cell分別發表新型冠狀病毒相關論文62、58和43篇,論文中應用的分離技術主要有親和色譜(AC)和尺寸排阻色譜(SEC)、液相色譜、磁珠分離和離心,研究內容涉及新型冠狀病毒的傳播、溯源、治療藥物、疫苗研發、臨床防治和疫情防控等方面。分析化學類專業期刊發表相關論文有限,代表性期刊Ana-lyticalChemistry在2020年全年僅發表14篇新型冠狀病毒研究論文,其中2篇報道采用微納分離技術對病毒進行高靈敏檢測。本文總結了分離技術在新型冠狀病毒研究、檢測和防疫中的應用,從親和色譜和尺寸排阻色譜、液相色譜、磁珠分離、離心、微納分離和電泳6個方面進行介紹。

      1AC和SEC

      親和色譜和尺寸排阻色譜是Nature,Science和Cell期刊報道文獻中使用最頻繁的蛋白質純化技術。其中,AC是通過生物分子與功能配基的特異性作用對目標蛋白質進行分離純化,是實驗室中生物大分子分離純化最具特異性和高效性的技術,但配基昂貴且偶聯技術復雜,限制了其應用;SEC是根據相對分子質量差異對待測物中各組分進行分離,優勢在于分辨率高,操作簡單,但對于樣品純度要求很高,因此常用于親和色譜后蛋白質的進一步純化。在當前新型冠狀病毒研究中,AC與SEC常被用于純化病毒表面S蛋白、ACE2、S蛋白受體結合域(RBD)等。

      1.1新型冠狀病毒傳播研究

      Shang等[3]使用鎳離子金屬螯合親和色譜(Ni-NTA)對多聚組氨酸標簽(His6-tag)標記的SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD以及ACE2胞外域分離純化,使用ProteinA親和色譜純化重組人APOM蛋白(Fc-tag)標記的ACE2,隨后用SEC對蛋白質進一步純化。通過比較分析ACE2對SARS-CoV-2、SARS-CoV以及蝙蝠冠狀病毒RaTG13的識別差異,揭示SARS-CoV-2在動物和人類之間的潛在傳播。以同樣方法分離純化SARS-CoV-2、SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的RBD以及ACE2胞外域后,Shang等[4]對比分析ACE2與3種病毒RBD的結合差異,為病毒干擾策略研究提供參考。

      1.2病毒感染機制研究

      Yan等[5]通過鏈霉親和素突變體(Strep-Tactin) 瓊脂糖凝膠和SEC純化了親水性多肽標簽(FLAG-tag)標記中性氨基酸轉運蛋白(B0AT1)和鏈霉親和素結合肽標簽(Strep-Tag)標記ACE2,研究在有無RBD的情況下,ACE2與B0AT1復合物的晶體結構差異,推動病毒感染的分子基礎研究。Hillen等[6]利用組氨酸標記(HisTrap)親和色譜柱純化冠狀病毒復制和轉錄的主要RNA聚合酶(Nsp12)及其輔助因子Nsp7和Nsp8,分析這些蛋白質與RNA依賴性聚合酶的結構,應用于病毒RNA復制研究。

      1.3新型冠狀病毒的藥物篩選及疫苗設計

      Gao等[7]用Ni-NTA親和色譜柱純化了Nsp12、Nsp7和Nsp8,解析了該聚合酶與抗病毒藥物瑞德西韋(remdesivir)的結合方式。Riva等[8]利用Ni-NTA親和色譜柱對SARS-CoV-2的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLpro)和主蛋白酶(Mpro)進行純化,從約12000個臨床階段的小分子藥物中篩選出13種具有治療效果的小分子抑制劑。

      Yuan研究組[9]將ProteinG親和柱用于患者體內SARS-CoV特異性人類單克隆抗體(CR3022)的純化,研究發現CR3022可有效結合SARS-CoV-2的RBD蛋白,是一種潛在的抗病毒藥物。Ju等[10]使用ProteinA親和柱對SARS-CoV-2感染者B細胞中RBD特異性單克隆抗體進行純化,從206種純化的單克隆抗體中發現抗SARS-CoV-2中和活性抗體,且該抗體基本不結合SARS-CoV和MERS-CoV。

      2液相色譜

      高效液相色譜(HPLC)具有高效、快速、靈敏度高、重復性好等特點,是化合物純度鑒定和生物大分子分析的通用分析方法。液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)在保留色譜技術高效分離優勢的同時,通過MS獲得待測組分豐富的結構信息,在藥物代謝、復雜基質單一成分鑒定、代謝組學研究等方面凸顯優勢[17]。

      2.1新型冠狀病毒候選藥物評估

      Zhang等[18]報告了冠狀病毒藥物靶標Mpro與α-酮酰胺抑制劑復合物的X射線結構,通過LC-MS/MS分析確定α-酮酰胺抑制劑13a和13b具有明顯的肺向性。Jin等[19]利用計算機輔助藥物設計篩選Mpro抑制劑,測定了10000多種藥物或活性化合物,并利用LC-MS/MS分析確定依布硒啉、PX-12和卡莫呋對Mpro的共價結合。

      Ma等[20]將非變性質譜(nativeMS)用于Mpro與4種潛在抑制劑(波普瑞韋、GC-376以及鈣蛋白酶抑制劑II和XII)的結合表征,結果發現此4種化合物均能明顯抑制SARS-CoV-2在細胞內復制。Maisonnasse等[21]基于LC-MS/MS研究了羥氯喹(HCQ)在體外和SARS-CoV-2感染獼猴中的抗病毒活性,通過定量分析血清、血液以及肺組織中HCQ含量,發現HCQ沒有明顯的預防感染能力。

      3磁珠分離

      磁珠分離技術可通過磁性顆粒表面修飾的官能團或特異性抗體,從復雜基質中選擇性結合靶標分子,并在外磁場輔助下實現目標物富集,其分離效率高、重復性好,但提取效率低且價格較高。

      當前,磁珠分離技術仍是新型冠狀病毒分離的主要方法,且有多款基于磁微粒-化學發光的檢測試劑盒通過國家藥監局審批。該試劑盒采用雙抗原夾心原理,形成化學發光劑/抗原-抗體-磁顆粒/抗原復合物,在磁場輔助下分離結合狀態和游離狀態的化學發光劑標記物,隨后加入發光促進劑進行發光反應,通過對發光強度的檢測進行定量或定性分析。磁珠分離技術還能與病毒核酸自動化提取設備配套使用,對大批量樣本的核酸進行提取,方法操作簡單,極大節約了時間和人工成本,可顯著提高核酸的檢測效率[25]。

      在新型冠狀病毒研究中,磁珠分離技術主要應用于細胞分離、核酸提取和免疫學檢測。Cao等[14]利用免疫磁珠從外周血單核細胞(PBMC)中負選分離到B細胞,并用結合腫瘤壞死因子受體超家族7(CD27)抗體的磁珠進一步分離得到CD27+記憶B細胞,通過高通量單B細胞測序對新冠康復期患者體內中和抗體進行鑒定。

      Zhao等[26]在磁性納米顆粒上涂覆了一層聚(氨基酯)-羧基,利用核酸與羧基之間強相互作用提取SARS-CoV-2的RNA。該方法將病毒遺傳物質裂解、提取和結合步驟組合到一起,得到的納米顆粒-RNA復合物不需要額外洗脫即可引入后續的反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR),極大提高COVID-19的診斷效率。Fabiani研究組[27]以磁珠為免疫載體,堿性磷酸酶為免疫標記二抗,開發了一種唾液中SARS-CoV-2快速檢測的電化學免疫分析法。所建方法可用于唾液臨床樣本中S蛋白和核衣殼蛋白(N蛋白)的檢測,檢出限分別為19ng/mL和8ng/mL。

      4離心

      離心技術操作簡易,成本較低,是通過控制離心機轉速實現樣品中蛋白質、核酸及細胞亞組分的分離。作為最基礎的分離技術,離心技術在新型冠狀病毒檢測中可用來分離血漿中的血清,用于抗體和抗原的檢測。在新型冠狀病毒實驗室研究環節,通過離心技術可分離鼻咽拭子中顆粒物質以及未消化的死細胞和纖維碎片,并反復離心清洗來沉淀純化病毒核酸。相比于普通離心技術,超速離心技術具有更強的離心力場,可迅速實現小顆粒(如病毒顆粒、蛋白質等)的沉降分離。

      Bao等[28]使用超速離心從VeroE6病變細胞中沉淀獲得病毒顆粒,研究了SARS-CoV-2在表達人ACE2轉基因小鼠中的致病性。Zost等[29]將超速離心用于S蛋白假型慢病毒的分離,來測定兩種單克隆抗體的中和能力,結果顯示假病毒比野生型病毒具有更敏感的中和表型,證明在單克隆抗體效果測定中使用活病毒的必要性。此外,聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度離心技術也被用于分離PBMC,以研究普通冠狀病毒和SARS-CoV-2的免疫學差異[30]。

      5微納分離

      材料科學和電子技術的進步帶動了微納分離技術發展,使其成為生物樣品分析的重要技術手段。微流控技術具有微型尺寸、樣品量小、快速擴散、比表面積大等優勢,常與其他技術結合,用于SARS-CoV-2相關蛋白質的高靈敏檢測。Lin等[31]開發了一種微流控免疫芯片,結合自制熒光檢測器分析檢測了SARS-CoV-23種生物標志物(IgG、IgM和抗原)。該方法快速、靈敏、便捷,在15min內即可完成SARS-CoV-2檢測。Xiong研究組[32]基于環介導等溫擴增技術(LAMP),開發了一種便攜式LAMP-微流控集成系統,該系統使用小型圓盤狀微流控芯片(81mm),可在40min內同時識別7種已知人類冠狀病毒。

      6電泳

      電泳技術利用帶電粒子在電場中移動速率不同而達到分離的技術,是生命分析領域重要分離手段之一。然而,在新型冠狀病毒研究中電泳的許多應用均可被分子生物學方法替代,且在實際檢測中相比于自動化設備和商品化試劑盒,其技術要求高,因而應用有限,亟待后續研究拓展[36]。

      其中,瓊脂糖凝膠電泳(AGE)是應用較多的電泳技術,常被用于聚合酶鏈式反應(PCR)產物分析。Kim等[37]對SARS-CoV-2的RNA基因組結構進行了解析,并用AGE方法驗證了測序發現的亞基因組RNA(sgRNAs),進而揭示基因在RNA基因組上的確切位置。Meza-Robles等[38]提出一步嵌套式RT-PCR,不需要實時熱循環儀,通過AGE即可實現新型冠狀病毒的定量檢測。該技術使用4個物種特異性的診斷引物,可同時實現特定區域擴增和陽性對照。Si等[39]對2188例疑似COVID-19患者的鼻咽拭子樣本進行分析,使用RT-PCR檢測SARS-CoV-2,PCR片段分析結合毛細管電泳檢測12種病毒,以研究SARS-CoV-2和常見呼吸道病毒的流行病學規律,以此提高疑似COVID-19患者的診斷效率。

      疾病檢測論文范例:門診管理對綜合醫院新型冠狀病毒肺炎疫情的防控

      7結論

      新型冠狀病毒研究已取得一定進展,分離技術在其中發揮著重要作用。其中,AC和SEC廣泛用于病毒相關蛋白質純化中;精密儀器制造業的發展,促使HPLC分離效率的提升,是完成高靈敏度、快速解決病毒代謝組學分析的關鍵手段;新材料和電子技術的進步,帶動磁珠和微納分離技術的靈敏度提升和應用范圍拓展,尤其是對化學試劑消耗降低,實現了對環境的友好,是解決細胞分析、核酸分離和免疫學檢測的首選技術;傳統的離心技術在病毒顆粒和細胞分離中發揮著不可替代的作用;電泳技術主要用于PCR產物分析。

      參考文獻:

      [1]LaiCC,ShihTP,KoWC,etal.IntJAntimicrobAgents,2020,55(3):105924

      [2]HuangCL,WangYM,LiXW,etal.Lancet,2020,395(10223):497

      [3]ShangJ,YeG,ShiK,etal.Nature,2020,581(7807):221

      [4]ShangJ,WanYS,LuoCM,etal.ProcNatlAcadSciUSA,2020,117(21):11727

      [5]YanRH,ZhangYY,LiYN,etal.Science,2020,367(6485):1444

      [6]HillenHS,KokicG,FarnungL,etal.Nature,2020,584(7819):154

      [7]GaoY,YanLM,HuangYC,etal.Science,2020,368(6492):779

      [8]RivaL,YuanSF,YinX,etal.Nature,2020,568(7827):113

      [9]YuanM,WuNC,ZhuXY,etal.Science,2020,368(6491):630

      作者:李林森1,朱超1,趙新穎2*,屈鋒1*

    亚洲AV片劲爆在线观看